2022年11月18日，《Nature Neuroscience》期刊在線發表了題為《Cortical Regulation of Two-stage Rapid Eye Movement Sleep》的研究論文，該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）劉丹倩研究組完成。該研究首次揭示并定義了小鼠快速眼動睡眠（REM睡眠）的兩個階段——安靜期和活躍期，其分別對應顯著不同的面部表情、自主神經活動和腦電頻譜。應用大規模寬場熒光鈣成像技術，該研究發現了小鼠壓后皮層（RSC）在REM睡眠中選擇性激活，并特異性地起始了跨腦區傳播的鈣波。結合雙光子成像、機器學習算法和光遺傳學等手段，明確了RSC在REM睡眠分期的編碼和調控中的重要作用。該研究實現了對REM睡眠分期和調控機制認識的重大突破，為探究夢境睡眠的復雜性提供了堅實的基礎。 

　　REM睡眠, 最早是由美國科學家Eugene Aserinsky發現并定義的，他在記錄兒子睡眠時發現了一種重復出現的睡眠狀態:眼部肌肉高度活躍。他后續證實了這是一種特殊的睡眠狀態，伴隨著腦電活動低頻高幅的活躍態、軀干肌肉的明顯僵直，并將其定義為REM睡眠。因其常伴隨著豐富生動的夢境，也被稱之為夢境睡眠。然而在REM睡眠被發現七十多年后，為什么在大腦皮層高度活躍的狀態能屏蔽外界刺激以維持睡眠，我們為什么會做夢，夢境中所伴隨的高度活躍的大腦皮層活動是否具有生物學意義，它們是如何參與到高級認知活動（比如記憶、情緒處理等），這些問題仍沒有明確的答案。從進化上來說，REM睡眠存在于鳥類、哺乳類等具有類大腦或大腦皮層的高等動物中，因此研究REM睡眠狀態下的大腦皮層活動以及調控機制對于研究神經系統在進化上的演變也有著重要的意義。然而，現有的研究大多是聚焦單個大腦皮層區域，具有很大的局限性。本研究對小鼠的整個背側皮層的鈣活動進行高時空分辨率的大規模檢測，從全局的視角來研究REM睡眠調控和大腦皮層活動之間的關系。 

　　為探究REM睡眠的大腦皮層活動，研究團隊在Thy1-GCaMP6s轉基因小鼠上安裝了覆蓋全背側皮層的透明玻璃窗口，以觀測全局的大腦皮層的鈣信號，并對小鼠的腦電、肌電、面部行為和血氧等進行了同時監測（圖A）。該研究首先發現，REM睡眠期大腦皮層的活躍模式與清醒期顯著不同，在空間獨立成分分析所獲得的十一個皮層功能模塊中，RSC腦區在REM睡眠特異性地高度活躍（圖A）。結合活動時序因果性分析（Granger causality）和時空序列分析（spatiotemporal “motif”），發現REM睡眠中大腦皮層有豐富的跨腦區傳播的鈣波，這些鈣波都特異性地起始于RSC（圖B）。利用雙光子顯微鏡進行單細胞分辨率的鈣成像，研究人員發現RSC的第二/三層（而非第五層）的錐體神經元在REM睡眠中顯著激活，說明RSC的選擇性激活還具有細胞層特異性（圖C）。 

　　有意思的是，在研究人員觀察小鼠REM期的面部視頻時，意外地發現除了間歇性的快速眼動之外，還有著持續的豐富面部運動，包括臉部咀嚼肌和胡須等的運動（圖D）。通過對面部表情或面部肌電進行特征分析和無監督聚類，研究人員發現REM睡眠包含了兩個不同的階段，即不具任何面部運動的“安靜”期（qREM）和具有面部運動的“活躍”期（aREM，圖D）。在這兩個REM階段中，面部運動、腦電頻譜和自主神經系統活動都存在顯著的差異，并且REM睡眠總是從qREM 過渡到aREM。有趣的是，在REM睡眠中，RSC第二/三層神經元的群體活動也呈現明顯的兩種不同模式的時序發放（圖C），而活動模式的切換與qREM→aREM的轉換完美吻合（圖E）。最后，研究者通過閉環系統在REM睡眠對RSC活動進行特異性抑制，發現小鼠REM睡眠片段化，qREM→ aREM的轉換和aREM的維持都有顯著降低，從而明確了RSC在REM睡眠亞階段轉換中的關鍵性作用（圖F）。 

　　該研究首次揭示并定義了REM睡眠的分期及其轉換規律，系統描繪了小鼠在REM睡眠中特征性的跨大腦皮層的鈣波。RSC神經元在介導皮層鈣波和調控REM睡眠分期中均發揮著必不可少的作用。近年來，基于non-REM睡眠的不同分期進行特異性神經活動觀測與調控的研究，使得人們對于non-REM的功能理解有了快速進展。該研究中所揭示的REM睡眠分期將極大地促進對REM睡眠功能的精準解析，并為理解夢境睡眠的復雜性提出了全新思路。 

　　該研究由中科院腦智卓越中心的博士研究生董宇凡在劉丹倩研究員的指導下完成，研究組的李嘉琪、周敏、杜熠輝也做出了重要貢獻。該研究得到中科院、科技部、基金委、上海市和臨港實驗室的資助。 

圖注（A）雙通道寬場熒光成像示意圖（上）；十一個功能模塊REM睡眠與清醒狀態活動差異（下）。（B）REM睡眠的三種主要鈣波（左）；REM睡眠中從RSC起始的鈣波活動示意圖，其中箭頭粗細代表RSC與目標區域間鈣活動的格蘭杰因果關系值。（C）通過雙光子成像得到RSC L2/3神經元活動并通過k-means聚類分成兩種類型，圖為一段REM睡眠中兩類RSC神經元鈣活動情況。（D）通過紅外相機采集到REM睡眠中小鼠的面部視頻（左上），其中小鼠眼睛、胡須和咀嚼肌位置的臉頰在REM睡眠后期有豐富的運動（右上）。下：利用HOG算法劃分REM睡眠亞狀態---qREM 和aREM。（E）RSC L2/3兩類神經元在REM睡眠亞狀態qREM到aREM 過程中的鈣信號變化（數據處理將qREM和aREM長度標準化到1）。（F）閉環光遺傳實驗示意圖（上）。在REM睡眠中特異性抑制RSC興奮性神經元阻斷了qREM到aREM的轉換以及aREM的維持（下）。